Eletroforese
A eletroforese é uma poderosa técnica laboratorial que separa moléculas com base na sua migração em um campo elétrico. Essa técnica é fundamental e está em constante evolução, com muitas atualizações e patentes sendo registradas. Ela permite a separação analítica de moléculas sintéticas e biológicas, sendo capaz de distinguir até mesmo moléculas muito semelhantes, como os diferentes tipos de ácidos graxos de 18 carbonos encontrados no azeite de oliva. O princípio por trás da eletroforese é a capacidade de separar substâncias (analitos) durante sua migração, de acordo com sua carga elétrica, tamanho e forma tridimensional (conformidade espacial), influenciadas pelo eletrólito tamponado onde as amostras são analisadas. A técnica foi descrita pela primeira vez em 1937 pelo bioquímico Arne Tiselius, com a eletroforese de fronteira móvel, que era realizada inteiramente em solução. Para aprimorar a separação, suportes sólidos como papel filtro e celulose foram introduzidos, permitindo uma separação mais eficiente das moléculas. A força elétrica (Felétrica) sobre um íon de carga 'q' em um campo elétrico de força 'E' é descrita pelas leis da eletrostática.
Pontos-chave
- Eletroforese separa moléculas pela migração em campo elétrico.
- Permite separar moléculas sintéticas e biológicas com alta precisão.
- Baseia-se em carga, tamanho e forma das moléculas.
- Evoluiu de métodos em solução para suportes sólidos e capilares.
- Fundamental para análise de DNA, RNA e proteínas.
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Nesta técnica, as amostras são aplicadas em uma tira de papel filtro ou acetato de celulose umedecida em solução tampão. As extremidades do papel são imersas em reservatórios com solução tampão onde os eletrodos estão localizados. Ao aplicar uma corrente contínua, os íons da amostra migram em direção ao eletrodo de polaridade oposta. A velocidade dessa migração depende da carga do íon e, em menor grau, de sua interação com a matriz do papel. Após a conclusão da separação (eletroforetograma), a tira é seca e métodos de detecção são aplicados.
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A eletroforese em gel é um método mais moderno e amplamente utilizado para separar macromoléculas, substituindo em grande parte a eletroforese em papel. As macromoléculas se movem através de um campo elétrico, passando pelos poros do gel. Essa técnica é ideal para a separação de DNA, RNA e proteínas. A escolha do tipo de gel – agarose ou poliacrilamida – depende das características do material a ser analisado.
Gel de Agarose
Géis de agarose são essenciais para a separação de DNA e RNA. A agarose, um polissacarídeo extraído de algas marinhas, é um polímero linear composto por unidades repetidas de agarobiose (L-galactose e D-galactose). Para formar o gel, a agarose em pó é dissolvida em um tampão por aquecimento e solidifica ao esfriar. Essa solidificação ocorre pela formação de pontes de hidrogênio, criando uma matriz porosa que permite a passagem de macromoléculas. O tamanho dos poros é ajustável pela concentração de agarose: concentrações mais baixas resultam em poros maiores, e concentrações mais altas, em poros menores.
Gel de Poliacrilamida
A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) é a técnica preferencial para separar proteínas e também pode ser usada para ácidos nucleicos menores. O gel é formado pela polimerização de monômeros de acrilamida com N,N-metilenobisacrilamida, que atua como agente de reticulação. A polimerização é iniciada por radicais livres, gerados pela decomposição de persulfato catalisada por TEMED. A velocidade de polimerização depende da concentração dos reagentes. A estrutura do gel, incluindo o tamanho dos poros, é determinada pela concentração total de acrilamida e N,N-metilenobisacrilamida.
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Introduzida em 1981 por Jorgenson e Lukacs, a eletroforese capilar utiliza capilares muito finos (10 a 100 μm de diâmetro interno), geralmente de sílica, vidro ou plástico. Sua estreiteza permite uma rápida dissipação de calor, permiindo o uso de campos elétricos mais altos e, consequentemente, tempos de separação mais curtos. A alta velocidade de separação também resulta em maior nitidez, pois minimiza o alargamento das bandas devido à difusão. Os capilares podem ser preenchidos com tampão, gel de SDS-poliacrilamida ou anfólitos. Essa técnica oferece alta resolução e permite a automação tanto da aplicação da amostra quanto da detecção, de forma similar à Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC).
