Enzima de restrição
As enzimas de restrição ou endonucleases de restrição como também são conhecidas, são enzimas que cortam a molécula de DNA através do reconhecimento de sequências nucleotídicas específicas.
As endonucleases de restrição são enzimas bacterianas que atuam como "tesouras moleculares", reconhecendo sequências de pares de bases específicas em moléculas de DNA e cortando-as nesses pontos. Elas são altamente específicas:cada tipo de enzima reconhece e corta apenas uma determinada sequência de nucleotídeo, em geral constituída por 4 ou 6 pares de bases azotadas. Estas enzimas funcionam nas células bacterianas como parte de um mecanismo de protecção ao ataque de bacteriófagos chamado sistema de restrição modificação. Uma molécula de DNA viral que contenha sítios para uma endonuclease bacteriana, ao ser injetada na bactéria, é prontamente cortada nesses pontos e deixa de funcionar. O DNA da própria célula bacteriana é protegido por metilação. Hoje são conhecidas centenas dessas enzimas, que são purificadas e comercializadas por diversos laboratórios no mundo. Além de evidenciar a existência de um novo sistema de defesa bacteriana e da complexa interação entre bactéria e vírus parasitas, a descoberta das enzimas de restrição permitiu grandes avanços na Genética Molecular. Por isso, os três pesquisadores responsáveis pela elucidação do mecanismo de ação das endonucleases de restrição, o suíço Werner Arber (n. 1931) e os norte-americanos Daniel Nathans (1928-1999) e Hamilton Smith (n.1931), receberam o Prêmio Nobel em Medicina ou Fisiologia em 1978.
Tipos de enzimas de restrição
Existem três tipos de enzimas de restrição: I, II ou III. A maioria das enzimas utilizadas hoje em dia são do tipo II, que têm o modo de acção mais simples. Estas enzimas são nucleases, e como cortam numa posição interna da cadeia de DNA, em vez de iniciar a sua degradação a partir de uma das pontas, são chamadas endonucleases. Assim, a designação mais correcta destas enzimas é endonucleases de restrição do tipo II, embora muitas vezes sejam simplesmente designadas como enzimas de restrição.
Utilização no corte de DNA genômico
A maioria dos cortes de DNA genômico é feita usando enzimas de restrição bacterianas. Estas enzimas cortam em seqüências-alvo específicas para DNA, chamados sítios de restrição, e esta propriedade é uma das características principais que tornam as enzimas de restrição adequadas para a manipulação do DNA. Qualquer molécula de DNA, seja ela derivada de um vírus, mosca ou humano, contém alvos para enzimas de restrição. A enzima de restrição cortará o DNA em um conjunto de fragmentos de restrição determinados pelas localizações dos sítios de restrição. Outra propriedade importante de algumas enzimas de restrição são as "pontas adesivas". Vejamos um exemplo. A enzima de restrição EcoRI (de Coli) reconhece a seguinte seqüência de seis pares de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo:
Desde de sua identificação, em 1970, mais de 100 diferentes tipos de enzimas de restrição bacterianas foram identificados. A nomenclatura compõe-se das iniciais do nome da espécie e, às vezes, da sigla da linhagem da bactéria que a produz.Por exemplo a enzima EcoRI, veja no box.
(a) Três hexanucleotídeos como sítios de reconhecimento e as enzimas de restrição que os cortam. Note que um sítio produz uma projeção 5', outro uma 3', e o terceiro um ponta romba. (b) Exemplo de enzimas que têm sítios de reconhecimento de tetranucleotídeos.
