CRISPR/Cas
Em biologia molecular, CRISPR/Cas é uma ferramenta de edição de genoma que consiste em dois componentes: uma transcrição do locus CRISPR que resulta em curtos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atua como um guia a um local particular no genoma, e uma proteína chamada Cas9 que corta o DNA nesse local.
Para que o sistema CRISPR/Cas9 funcione, uma proteína de defesa bacteriana com Cas9 procura um motivo protospacer adjacente (PAM) - que está presente no DNA viral, mas não no DNA bacteriano. O CRISPR/Cas9 foi aproveitado para editar o genoma humano, porque essas seqüências de PAM também são bastante comuns em nosso DNA; no entanto, genes que não estão próximos de um PAM não podem ser direcionados. Os bioquímicos projetaram variações de uma proteína Cas9 que não requer um PAM específico para ligar e cortar o DNA. As duas novas variações de Cas9, denominadas SpG e SpRY, permitem a edição de seqüências de DNA com eficiência não alcançável com as enzimas CRISPR/Cas9 convencionais.
O sistema imunológico adaptativo CRISPR/Cas de procariontes se dividiu em duas classes distintas baseadas na organização do módulo efetor. Devido à complexidade da composição genética e arquitetura genômica dos sistemas CRISPR/Cas, qualquer critério de classificação único e abrangente é considerado impraticável, e assim uma abordagem "politetânica" baseada em evidências combinadas de análise filogenética, genômica comparativa e estrutural foi desenvolvido. Com base nas duas classes distintas, o sistema CRISPR/Cas é dividido em seis tipos principais (tipo I - tipo VI). Dentro de cada tipo de sistema CRISPR/Cas, vários subtipos foram delineados com base em genes de assinatura adicionais e arranjos genéticos característicos.
Classe 1
Os sistemas CRISPR/Cas de Classe 1 são definidos pela presença de um complexo efetor de crRNA polissubstituído e são divididos em 3 tipos e 15 subtipos. Os sistemas de Classe 1 representam cerca de 90% dos locos CRISPR/Cas e são encontrados em diversos filos bacterianos e arqueas. Inclui o mais comum e diversificado tipo I, tipo III, que é representado em numerosas archaea, mas é menos freqüente em bactérias, assim como o tipo IV raro, que inclui locos CRISPR/Cas rudimentares, sem o módulo de adaptação. Além dos genes efetores, a maioria dos loci de classe 1 codifica as proteínas do módulo de adaptação Cas1 e Cas2, e múltiplas proteínas acessórias, como Cas4, transcriptase reversa, proteína contendo o domínio CARF (associado a Rossmann) e outros. Os sistemas tipo III e tipo IV freqüentemente não possuem genes modulares de adaptação e / ou matrizes CRISPR em seus respectivos loci. Todos os sistemas do tipo I também codificam DNA helicase Cas3, que é frequentemente fundido a um domínio de nuclease da família HD. As repetições dos sistemas de classe 1 são geralmente palíndricas. Em sistemas do tipo I, um motif adjacente protospacer (PAM), que varia entre os subtipos e está localizado a 5 ′ ou 3 ′ do espaçador (proto), é necessário para adaptação e interferência.
Classe 2
Os sistemas CRISPR/Cas Classe 2 são definidos pela presença de um módulo efetor de crRNA de uma única subunidade e são divididos em 3 tipos e 18 subtipos. Os módulos efetores da Classe 2 consistem de uma única, grande, proteína multi-domínio, de tal forma que os respectivos locos CRISPR/Cas têm uma organização muito mais simples e uniforme do que os da Classe 1. Os sistemas Classe 2 representam cerca de 10% da CRISPR/Cas loci e são encontrados em diversos filos bacterianos, mas praticamente ausentes em archaea. Além das proteínas efetoras, a maioria dos locos genômicos da Classe 2 codifica a proteína do módulo de adaptação, Cas1 e Cas2, e proteínas acessórias, como a Cas4. Os loci de tipo II e tipo V-B também incluem tracRRNA (RNA de CRISPR trans-ativador), que é parcialmente complementar às repetições e está envolvido no processamento e interferência de RNA de CRISPR (cr). Alguns sistemas da Classe 2, no entanto, especialmente os do tipo VI, consistem apenas em um arranjo CRISPR e uma proteína efetora.
CRISPR/Cas é efetivamente uma de ocorrência natural, um mecanismo antigo de defesa encontrado em uma vasta gama de bactérias. Em retrospecto, os pesquisadores provavelmente deveriam ter previsto que as bactérias e archaea teriam sistemas imunológicos sofisticados. Afinal de contas, os vírus são os mais abundantes agentes biológicos do planeta, causando cerca de 1023 infecções a cada segundo. De qualquer forma, no final dos anos 1960, Robert N. Yoshimori isolou de uma enzima chamada EcoRI. Outros cientistas logo mostraram como a enzima funcionava como um par de tesouras moleculares, a clivagem de DNA em uma única seqüência. Este tipo de corte permitiu colar juntos DNA circulares de vírus chamados plasmídeos, ou mesmo segmentos de genes humanos, e emenda-los juntos as extremidades do código. Já na década de 1980, os cientistas observaram um estranho padrão em alguns genomas bacterianos. Essas repetições foram descritas pela primeira vez em 1987 por Yoshizumi Ishino e colegas da Universidade de Osaka, no Japão quando publicaram a sequência de um gene para a bactéria Escherichia coli para entender melhor como o gene trabalhava. CRISPR evoluiu através da aquisição de fragmentos curtos de ADN derivado de fagos e linhagens novas com espaçadores que são resistentes a estes fagos.
Aplicações de CRISPR/Cas9 abrangem quase todos os setores envolvendo sistemas biológicos. Danisco. Aplicações na agricultura têm obstáculos regulatórios mais baixos do que aplicação biomédica e alguns desses mercados estão previstos a produzir retornos sobre os investimentos muito rapidamente. Dow AgroSciences co-desenvolveu propriedade intelectual com Sangamo Biosciences para o desenvolvimento de culturas geneticamente modificadas utilizando Cas9, e Cellectis Ciências Vegetais está levando a tecnologia para as plantações. Pela primeira vez, em 2016, plantas modificadas com as "tesouras CRISPR/Cas9" têm sido cultivadas, colhidas e cozidas. A refeição foi um prato de macarrão que incluiu 300 gramas de repolho. Além da exploração agrícola, os investigadores estão considerando como CRISPR/Cas9 poderia ou deveria ser implantado em organismos em estado selvagem. Grande parte da atenção tem-se centrado no método chamado um gene-guia, que pode varrer rapidamente um gene editado do meio de uma população. O trabalho está em um estágio inicial, mas tal técnica pode ser usada para acabar com os pernilongos ou carrapatos transmissores de doenças, eliminar plantas invasoras ou erradicar a resistência a herbicidas em caruru. Da mesma forma, Recombinetics Inc. está usando TALENs, ZFNs e Cas9 para aumentar a produtividade no setor da pecuária.
Bebês projetados
CRISPR/Cas9 é uma maneira eficaz de manipular o genoma in vivo em animais, bem como em células humanas in vitro, mas algumas questões com a eficiência de entrega e edição significam que não é considerado seguro para uso em embriões humanos viáveis ou na células germinativas do corpo. Além da maior eficiência do NHEJ, é provável que o CRISPR possa introduzir DSBs em partes não intencionais do genoma, chamadas de efeitos fora do alvo. He Jiankui foi um pesquisador pela universidade chinesa SUSTech, mas ele estava sob licença não remunerada desde fevereiro de 2018. Jiankui pesquisava sobre CRISPR/Cas na universidade. Em novembro de 2018, Jiankui revelou que havia editado o gene CCR5 em dois embriões humanos, com o objetivo de que os bebês não expressassem um receptor para o vírus HIV. As garotas, que o cientista chamou de "Lulu" e "Nana", nasceram poucas semanas antes do anúncio do cientista. A pesquisa foi duramente criticada, sendo considerado um experimento perigoso e prematuro por parte de Jiankui.
Terapêutica
Ao longo dos últimos anos, o sistema CRISPR/Cas teve pequenos problemas para a sua utilização terapêutica potencial em terapia génica, com o CRISPR de ARN identificando o alvo da parte relevante de ADN e a proteína Cas clivando. No entanto, o grande problema era o fato de que, para Cas9 para ser eficaz, deveria primeiro ser capaz de entrar nas células-alvo de forma eficiente. Desde de 2015, uma equipe de pesquisadores da Carolina do Norte criou e utiliza um veículo em nanoescala composto de ADN para entregar o complexo edição CRISPR/Cas9 em células tanto in vitro e in vivo. Quando o nanoclew entra em contato com uma célula, a célula absorve o nanoclew completamente através de mecanismos típicos de endocitose. Os nanoclews são revestidos com um polímero carregado positivamente, com o fim de quebrar a membrana endossomal e libertar nanoclew no interior da célula. O complexos CRISPR/Cas9, em seguida, libertam-se da estrutura de ADN para abrir caminho para o núcleo. Uma vez que o complexo CRISPR/Cas9 atinge o núcleo, então, a edição do gene pode começar.
Controle de doenças
Resistência a doenças é uma das aplicações mais populares para CRISPR/Cas na agricultura, e os cientistas estão trabalhando em um amplo espectro de animais. Cientistas esperam que esta ferramenta possa ajudar a conter a perda dramática de abelhas em todo o mundo. Ao manipular os genes, as colônias são menos propensas a sucumbir a ácaros, fungos e outros agentes patogênicos O sistema criou CRISPR porcos que são resistentes a doenças virais, incluindo porcos com uma proteína mutada na superfície das suas células, o que deve torná-los impermeáveis a um vírus respiratório mortal. Os pesquisadores estão trabalhando em fazer bovinos resistentes aos parasitas tripanossoma que são responsáveis pela doença do sono.
Espécie ameaçada
A técnica CRISPR/Cas9 é um dos métodos mais amplamente propostos para clonagem. O método tem sido aplicado às espécies ameaçadas e há vários esforços para trazer de volta o mamute-lanoso além de oportunidades com animais como ursos, e também em aves. Pesquisadores da Universidade de Stanford criaram o primeiro coral geneticamente modificado usando o CRISPR para editar três genes em corais que crescem na Grande Barreira de Corais da Austrália. Dois dos genes são responsáveis pela coloração do recife e um está envolvido na regulação de como o novo coral se instala e cresce em um recife. Usando CRISPR demonstrou-se que os embriões resultantes continham os genes mutados. Os resultados sugerem que o CRISPR poderia ser usado para, eventualmente, ajudar os cientistas a manipular os genes para que possam se tornar mais resistentes ao branqueamento causado por estresses ambientais como o aquecimento global e a poluição.
Lacticínios
Danisco (DuPont) foi um dos pioneiros na utilização comercial da tecnologia CRISPR/Cas para aumentar a imunidade viral em bactérias utilizadas para fazer iogurtes e queijo, mas outros mercados vêm emergindo rapidamente. DuPont utiliza CRISPR para desenvolver culturas naturais com uma estrutura interna de imunidade aos fagos que geralmente atacam durante a produção de queijo. Ao contrário das culturas utilizadas para rotações convencionais em fábricas lácteos fermentados, "CHOOZIT" são caracterizados pela suas idênticas funcionalidade permitindo que cada membro da rotação execute exatamente da mesma maneira. A única diferença reside na sua imunidade a fagos. Os principais benefícios incluem melhorias de produtividade, otimização de tempo de processo e minimização de "downgrades" de produtos, graças a inovação técnica CRISPR que permite a rotação de culturas, sem variabilidade indesejada.
Pecuária
Dr. Scott Fahrenkrug de Recombinetics anunciou, em julho de 2015, que desenvolveu uma maneira de editar os genes de animais para mudar traços específicos, tanto para usos agrícolas e biomédicos. Ele desenvolveu uma forma de editar os genes de animais de fazenda para alterar características específicas. Ele podem editar o traço que faz crescer chifres no gado. Isso significa que uma vaca não nasce com chifres, e nunca precisa se submeter ao processo sangrento de descorna. Usando o método CRISPR/Cas, os investigadores podem fazer que uma parte pequena do genoma do gado leiteiro assemelhar-se o genoma de sem chifres gado Red Angus. Isso significa que eles podem remover seus chifres sem fazer quaisquer outras alterações genéticas. Um outro exemplo do uso de CRISPR para para mudar traços específicos é o caso do trabalho com células musculares em porcos. Os bovinos Belga Azul são enormes e fortes animais que fornecem excepcionalmente grandes quantidades de valorizado, cortes magros de carne, resultado de décadas de cruzamentos seletivos, porém, uma equipe de cientistas da China, através da edição de um único gene criaram o equivalente suíno utilizando o método TALENs de edição genética que, muito mais rapidamente, introduz uma mutação no gene da miostatina em células fetais de porco que faz com que células musculares se multiplicarem
Em 2019, na primeira série de ensaios clínicos, os cientistas estão usando CRISPR/Cas9 para combater o câncer e distúrbios sangüíneos em pessoas. Nesses testes, os pesquisadores removem algumas células de uma pessoa, editam o DNA e, em seguida, injetam as células de volta, agora esperamos que estejam armadas para combater as doenças. Os pesquisadores também estão preparados para ver como o CRISPR/Cas9 funciona dentro do corpo humano. Em um próximo teste, pessoas com uma cegueira herdada terão a tesoura molecular injetada em seus olhos.
CRISPR optogenético é uma nuclease Cas9 ativada por luz que oferece aos investigadores maior controle espacial e temporal sobre a atividade de nuclease guiada por ARN. Assim, proporcionando extremamente preciso da edição de genes. Em células humanas, paCas9, um manipulado Cas9 fotoativável permite o controle optogenético da edição do genoma CRISPR/Cas9. O paCas9 consiste em fragmentos de Cas9 divididos e domínios de dimerização foto-indutíveis denominados "ímãs". A atividade de edição do genoma pode ser desligada simplesmente apagando a luz e também a ativação de paCas9 em amostras espaciais determinadas pelos locais de irradiação.
Em abril de 2015, quando os cientistas na China relataram a realização do primeiro experimento usando a edição CRISPR de genomas para alterar o DNA de embriões humanos, potencialmente afetando a linha germinal, inflamou ainda mais o protestos de cientistas que advertem que tal passo, atravessou uma linha ética. Este anúncio tocou os sinos de alarme éticos, não apenas religiosos obcecados e transgênicos cautelares, mas de um grupo de 18 proeminentes cientistas e especialistas em direito e ética que publicou uma carta pedindo uma moratória sobre alguns usos dessa tecnologia. Os cientistas afirmam que a técnica de edição CRISPR pode modificar os genomas dos seres humanos e outras espécies de uma forma que poderia ter "efeitos imprevisíveis sobre as gerações futuras" e "implicações profundas para a nossa relação com a natureza". Independente da controvérsia, em setembro de 2015, cientistas do Instituto Francis Crick pediram ao órgão regulador do Reino Unido de tratamento e pesquisa de fertilidade, para obter uma licença para conduzir edição de gene CRISPR/Cas9 em embriões para um estudo de investigação sobre por que algumas mulheres têm aborto espontâneo, e em janeiro de 2016, a permissão para editar os genomas de embriões humanos para a pesquisa foi concedida para os cientistas em Londres. A avaliação de ameaça global divulgada em 2016, pelo diretor nacional de inteligência dos EUA, colocou esta edição de genoma entre uma das seis ameaças listadas na seção sobre as armas de destruição em massa. Em 2017, a técnica com proteínas anti-CRISPR (que anulam o efeito de CRISPR/Cas9 utilizando proteínas que são produzidas por vírus bacterianos) foram descobertas e podem ser usadas em bactérias - como E. coli - bem como em células humanas modificadas. O anti-CRISPR tem o potencial de melhorar a segurança ea precisão das aplicações CRISPR tanto no uso clínico como na pesquisa básica; assim, reduzindo as principais preocupações éticas e a necessidade de ações regulatórias da técnica CRISPR.
Em abril de 2014, uma patente aberta, nos EUA, foi atribuída a Feng Zhang, um cientista do Instituto "Broad" MIT-Harvard que afirma ter descoberto a eficácia das CRISPR/Cas9 na edição de genes em células humanas. Zhang apresentou sua patente com a data de prioridade de dezembro de 2012. Apenas alguns meses mais tarde, o prêmio "Breakthrough" foi atribuído a J. Doudna e E. Charpentier pela contribuição para a descoberta de CRISPR. Doudner e Charpentier registraram uma patente com a data de prioridade de 25 de maio de 2012, que inclui 155 reivindicações, englobando inúmeras aplicações do sistema para uma variedade de tipos de células. Todas as partes nesta disputa fundaram empresas de biotecnologia na corrida para desenvolver CRISPR como medicamento clínico viável. Zhang co-fundou Editas Medicine com Doudner antes desistir e vir a fundar Caribou Biosciences e Intellia Therapeutics. Charpentier é a fundadora da CRISPR Therapeutics, mas já vendeu os direitos dessa empresa. Feng Zhang ganhou os direitos de patente depois de apresentar provas de que ele foi o primeiro a elaborar editores de genes baseados em CRISPR.
Em 2015, Jennifer Doudna, um bioquímica da Universidade da Califórnia co-fundadora de "Editas Medicine", e sua colaboradora, Emmanuelle Charpentier do Centro Helmholtz para Pesquisa de Infecções na Alemanha, receberam $3 milhões de dólares cada uma pela invenção da revolucionária ferramenta para a edição de DNA CRISPR. Em agosto de 2015, Bill Gates e 13 outros investidores colocaram $120 milhões em "Editas Medicine" e em setembro, Intellia Therapeutics, que desenvolveu maneiras de corrigir os genes defeituosos com tratamentos de edição de genes para doenças do fígado e do sangue, recebeu $70 milhões de investidores. O ODIN (ou "Open Discovery Institute"), um dos projetos do Indiegogo, tentando facilitar e incentivar a investigação em biologia sintética em casa, o "faça você mesmo", está vendendo kits completos de engenharia de genoma para que cientistas amadores e fãs possam experimentar a edição de repetições palindrômicas curtas de gene por si próprios.
