CRISPR
O sistema CRISPR, ou seja, Repetições Palindrômicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas, consiste em pequenas porções do DNA bacteriano compostas por repetições de nucleotídeos. Cada uma dessas repetições encontra-se adjacente a um “protoespaçador”, que corresponde a uma região não-codificante inserida no DNA bacteriano após o contato com genomas invasores provenientes de bacteriófagos ou plasmídeos. A transcrição do locus CRISPR resulta em pequenos fragmentos de RNA com capacidade de desempenhar o reconhecimento de um DNA exógeno específico e atuar como um guia de modo a orientar a nuclease Cas, que irá promover a clivagem e consequente eliminação do DNA invasor caso este entre novamente em contato com a bactéria, atuando como importante mecanismo de defesa contra DNAs invasores.
Originalmente encontradas no genoma de Escherichia coli em 1987 e descritas por Yoshizumi Ishino e colaboradores, as sequências curtas intercaladas regularmente só começaram realmente a ser investigadas no início dos anos 2000, sendo então encontradas em diversos outros organismos procarióticos, tanto do domínio Bacteria, quanto Archaea e em 2002 a sigla CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) foi criada para denominar tais sequências. Francisco Mojica descobriu CRISPR de forma independente em 1993 e em 2003, ele descobriu que o DNA repetitivo nas bactérias geralmente ficava ao lado de pedaços de DNA que combinavam com vírus que atacavam esse tipo de bactéria. Somente em 2005 foram obtidas as informações necessárias para indicar a função destes loci. Foi descrito que as sequências espaçadoras têm origem extracromossômica, sendo derivadas de sequências de plasmídeos ou de vírus. Além disso, foi também descrito que vírus tornam incapazes de infectar arqueias que possuem sequências espaçadoras correspondentes ao seu genoma, inseridas após uma infecção prévia.
Imagem: National Institutes of Health (NIH) · PDM · Openverse
O locus CRISPR é composto por cerca de 20 a 50 pares de base, normalmente dispostos simetricamente, o que favorece a formação de uma estrutura em “grampo” ou “hairpin”. Neste locus são encontradas repetições separadas por protoespaçadores de tamanho similar, os quais podem ser adicionados rapidamente como parte da resposta imune bacteriana contra infecção ocasionada por fagos além de variar em tamanho e sequência. Têm sido descrito que dentre os 198 genomas completos disponíveis no banco de dados NCBI, é possível encontrar cerca de 50 genomas onde o gene Cas1 está presente. Além disso, sabe-se que a grande maioria dos “protoespaçadores” possui homologia com genes conhecidos, frequentemente provenientes de elementos extra-cromossômicos tais como fagos e plasmídeos. Em Yersinia pestis estas repetições ocorrem preferencialmente pela absorção do DNA de bacteriófagos. O primeiro estudo demonstrando como ocorre o direcionamento do complexo CRISPR/Cas9, de modo a permitir a ligação com a sequência complementar do gene alvo, e eliminação de um agente infeccioso em bactérias ocorreu em Streptococcus thermophilus em 2010.
Imagem: National Institutes of Health (NIH) · BY-NC-SA · Openverse
De maneira geral, todos os mecanismos CRISPR expressam as mesmas vias de aquisição, expressão e interferência, conforme descrito a seguir : a) Aquisição de novos protoespaçadores: Geralmente realizada através do reconhecimento e clivagem de ácidos nucleicos exógenos mediados por Cas1 e Cas2 para sua integração ao cromossomo bacteriano em regiões conhecidas como locus CRISPR. b) Transcrição completa do locus CRISPR como um pre-crRNA: Processamento e amadurecimento do transcrito em pequenas moléculas de RNA (crRNA) capazes de reconhecer uma única sequencia alvo. c) Associação com proteínas Cas: Formação de complexo ribonuclear capaz de guiar nucleases de maneira especifica em direção ao DNA alvo presente em bacteriófagos e plasmídeos.
Aquisição de Protoespaçadores
A integração de uma nova informação nos loci CRISPR inicia-se pela imunidade bacteriana mediada por esse sistema, onde uma pequena porção do DNA invasor, é integrada ao locus CRISPR do hospedeiro como um protoespaçador através da atuação de nucleases específicas. Devido à alta afinidade encontrada entre a nuclease Cas1 e ácidos nucleicos, tem sido sugerido que esta enzima possua papel significativo no que se refere a integração e aquisição de novos protoespaçadores. Além disso, a ausência de necessidade de uma sequencia especifica de nucleotídeos para o acontecimento deste tipo de ligação com a Cas1 reforça esta ideia, uma vez que esta poderia atuar sobre qualquer seqüência protoespaçadora presente no genoma viral.
Transcrição do locus CRISPR
O sistema CRISPR Tipo I pode ser dividido em 6 subtipos categorizados de A a F. Neste sistema, a transcrição do locus CRISPR é seguida pela dobragem sobre si mesma das sequências repetidas para formar estruturas em grampo (hairpins) entre os protoespaçadores, seguida da clivagem do transcrito mediada pela nuclease Cas6e/f originando crRNA. Um complexo efetor conhecido como Cascade (Complexo associado a CRISPR para defesa antiviral) reúne cinco proteínas Cas ligadas ao crRNA. Este complexo é direcionado à sequência apropriada presente no DNA invasor por meio de reconhecimento do domínio PAM na fita complementar do crRNA . Uma vez que a identificação da sequência tenha sido estabelecida, uma mudança conformacional em Cascade recruta Cas3, a qual cliva o ácido nucleico invasor de modo sequência-específica.
Imagem: National Institutes of Health (NIH) · BY-NC · Openverse
Inúmeras são as vantagens obtidas pelo emprego do sistema CRISPR uma vez que trata-se de uma metodologia rápida, fácil com baixo custo e principalmente com alta taxa de sucesso devido a sua alta sensibilidade para o reconhecimento de sequências específicas presentes no DNA alvo de células em cultura ou até mesmo em modelos animais. Com o emprego desta metodologia é possível avançar mais rapidamente no ramo da engenharia genética e no estudo funcional gênico, o que pode ser justificado pela capacidade desta ferramenta em excluir ou modificar genes específicos para obtenção de organismos geneticamente modificados passíveis de serem empregados como modelo de estudo para compreensão de condições fisiopatológicas nas mais diversas espécies.
Imagem: jurvetson · BY · Openverse
Aplicações de CRISPR abrangem quase todos os setores envolvendo sistemas biológicos. Danisco (DuPont) foi um dos pioneiros na utilização comercial da tecnologia CRISPR para aumentar a imunidade viral em bactérias utilizadas para a produção de iogurtes e queijos. Aplicações na agricultura têm obstáculos regulatórios mais baixos do que aplicação biomédica e alguns desses mercados preveem o retorno dos investimentos muito rapidamente. Dow AgroSciences desenvolveu propriedade intelectual com Sangamo Biosciences para o desenvolvimento de culturas geneticamente modificadas utilizando Cas9, e Cellectis Ciências Vegetais está levando a tecnologia para as plantações . CRISPR tem o potencial para se tornar uma força importante na ecologia e conservação, especialmente quando combinada com outras ferramentas de biologia molecular. Pode, por exemplo, na criação de genes que atrasem disseminação de espécies invasoras como ervas daninhas. Pode vir a ser o próximo grande salto na conservação ou melhoraria do meio ambiente. Aplicações baseadas em Cas9 na indústria agrícola e em setores da saúde humana encontram-se em crescimento acelerado. Estes mercados incluem: terapia gênica, terapia celular e imunoterapia, o desenvolvimento rápido e eficiente de pesquisa de animais transgênicos, descoberta de medicamentos, bem como a validação de alvo e de triagem .
Regulação
A modulação da transcrição de diferentes alvos genéticos tem usado cada vez mais a tecnologia CRISPR/Cas9 em substituição aos modelos atuais, como RNA interferência, ZFN e TALENs. Estas técnicas apresentaram limitações por serem trabalhosas e demoradas, enquanto que nas primeiras tentativas de inativação de gene alvo com CRISPR/Cas9 foram obtidos bons resultados. Conforme citado anteriormente, o uso em produtos laticínios é um dos principais exemplos de aplicação. Tais produtos comumente sofrem infecções por fagos o que prejudica ciclos de fermentação normais e diminui a qualidade do produto final. Para contornar esse problema as indústrias criaram cepas de bactérias resistentes a fagos.
Modelos celulares e animais
A caracterização dos fenótipos da doença é um dos principais objetivos para a geração de animais geneticamente modificados. Transformações genéticas em animais, simulando as mutações encontradas em humanos, permitem determinar a função de genes, estruturas reguladoras e confirmação de resultados obtidos em cultura de células. A edição genômica mediada por Cas9 permitiu geração acelerada de modelos geneticamente modificados e ampliando as pesquisas biológicas tradicionais de estudo de organismos-modelo, podendo ser aplicada para desenvolver novas modificações gênicas com introdução ou correções de mutações específicas in vivo . Como exemplo disso, já foi possível observar modificações de genes alvo de forma eficaz através da micro-injeção em células embrionárias de peixe-zebra, injetando mRNA que codifica uma Cas9 personalizada. Ou ainda a injeção de Cas9/mRNA e sgRNAs com diferentes genes alvos de zigotos de camundongos, levando ao desenvolvimento de mutações em determinados alelos, reforçando que a utilização de CRISPR/Cas pode ser empregado para a modificação de múltiplos genes ao mesmo tempo .
Mapeamento genômico e funcional
A identificação de genes responsáveis por um dado fenótipo de interesse é facilitada pelo sistema CRISPR/Cas9, devido a sua habilidade de alterar diferentes alvos, individualmente ou mesmo simultaneamente . Estudos realizados com a tecnologia de CRISPR estão confirmando sua capacidade de rastreio genômico através da manipulação dos domínios catalíticos de Cas, sendo possível a construção de sistemas de repressão (CRISPRi) e ativação (CRISPRa) . A CRISPRi é usada para controle da transcrição com uso de Cas9 (dCas9) com mutações nos domínios catalíticos tornando-a deficiente em atividade nucleolítica ou através de sgRNA sendo utilizado como alvo na região do promotor, gerando impedimento estérico na associação entre os motivos de DNA e seus fatores de transcrição, levando a contenção do início da transcrição. Sendo assim, CRISPRi é uma forma eficiente de redirecionamento do genoma para a manipulação da transcrição sem modificar a sequência de alvo de DNA.
CRISPR no tratamento de doenças infecciosas
Conforme definição o complexo CRISPR/Cas age como um sistema imune adaptativo antiviral em bactérias, dessa forma, pode ser empregado para o tratamento de doenças infecciosas em indivíduos contaminados pela eliminação do genoma do agente infeccioso . O uso desse sistema tem destaque especial na terapia de HIV através do bloqueio da proliferação do vírus. Demonstrou-se que perturbação da região LTR (repetições longas terminais) pode ser realizada em vírus HIV-1. O DNA do vírus contém duas regiões LTR e ambas as extremidades podem se integrar ao genoma, o que significa que o sistema CRISPR/Cas9 tem a capacidade de remover a sequência do HIV associado por clivagem em ambas as LTRs, retirando assim a sequência de HIV integrada ao DNA de indivíduos infectados. A técnica ainda se encontra em um estágio inicial, mas se mostra muito promissora na determinação de alvos através de um sistema de entrega segura e eficaz.
Correções de desordens genéticas
A tecnologia CRISPR-Cas9 também vem sendo amplamente estudada como ferramenta na cura de doenças genéticas. Usando camundongos como modelo, por exemplo, a falha genética causadora da catarata foi corrigida (reparo do fenótipo funcional da doença) pela injeção de CRISPR/Cas9 em zigotos. De acordo com análises de sequenciamento de DNA, foram observadas que as modificações necessárias ocorreram somente no alelo mutante dos animais portadores da doença e não afetaram os demais genes, confirmando a especificidade do sgRNA em atingir exclusivamente o alelo mutante. Camundongos já foram usados como modelo na correção do gene mutante da distrofina, evitando o desenvolvimento de distrofia muscular e também no reparo do locus do receptor transmembranar da fibrose cística por recombinação homóloga de células-tronco intestinais cultivadas de pacientes humanos com esta doença, evidenciando a CRISPR como técnica promissora para a terapia genética em pacientes humanos. Os pesquisadores têm utilizado para tratar uma forma grave de distrofia muscular em camundongos. Eles empregaram CRISPR/Cas para cortar a parte de um gene defeituoso com distrofia muscular de Duchenne, permitindo que os animais a fazer uma proteína muscular essencial. A abordagem é a primeira vez que CRISPR foi entregue com sucesso por todo o corpo para o tratamento de animais adultos com uma doença genética.
Imagem: National Institutes of Health (NIH) · BY-NC · Openverse
Como toda aplicação do ramo da Biotecnologia, o uso da nova técnica traz à tona discussões nos campos da ética e da segurança biológica, em grande parte pelo fato de que suas aplicações estão fortemente ligadas a interesses econômicos de diversos grupos e empresas. Atualmente já se negociam bilhões de dólares e travam-se na justiça disputas acirradas sobre vários aspectos das patentes que podem ser geradas. Citando o artigo publicado no jornal Zero Hora pela Professora Cristina Bonorino, titular de Imunologia da PUCRS e pesquisadora 1C do CNPq: "As pesquisadoras que primeiramente desvendaram o mecanismo de funcionamento do sistema CRISPR, duas da Universidade da Califórnia em Berkeley, Jenifer Doudna e Jill Banfield, e a francesa Emmanuelle Charpentier, patentearam o sistema pensando no potencial para testes diagnósticos de vírus. Publicaram seus achados na Science em 2012, e seguiram-se uma enxurrada de premiações, milhões de dólares captados para as empresas de biotecnologia que fundaram e sua inclusão na lista das 100 pessoas mais influentes no mundo pela revista Time. Enquanto isso, a DuPont anuncia que alimentos editados com CRISPR estarão em nossas mesas em menos de cinco anos. Eles também patentearam usos do sistema para modificar sementes e probióticos.
Imagem: National Human Genome Research Institute (NHGRI) from Bethesda, MD, USA · BY · Openverse
Como verificamos CRISPR apresenta diversos campos de aplicação, assim suas funções podem ser resumidas em:
