Cromatografia gasosa bidimensional abrangente GC×GC
A cromatografia gasosa bidimensional abrangente GCxGC é uma técnica descrita originalmente em 1991 pelo professor John B. Phillips e seu aluno Zaiyou Liu. Desde então a GC×GC vem sendo extensivamente aplicada para solucionar problemas complexos de separações. Alguns dos grupos de pesquisa mais bem consolidados no mundo nessa técnica são encontrados na Austrália, Itália, Holanda, Canadá, Estados Unidos e no Brasil.
A invenção da cromatografia gasosa (CG) geralmente é atribuída a A.T. James e A. J. P. Martin por um trabalho publicado em 1952, quando eles testaram a separação usando um gás como fase móvel pela primeira vez. A separação por cromatografia gasosa-líquida de oito ácidos graxos voláteis foi efetuada em uma coluna empacotada de 11 pés, à 137ºC e 100 minutos de duração. Nessa separação unidimensional com nitrogênio gasoso como fase móvel e óleo de silicone/ácido esteárico apoiada em terra diatomácea como fase estacionária, foram identificados aproximadamente 30 picos lado a lado. A técnica despertou o interesse da indústria petroleira que necessitava separar e analisar misturas de hidrocarbonetos. Um dos maiores desafios analíticos dos anos 50 foi estabelecer a composição do petróleo, que substituiu o carvão como a principal fonte de combustível líquido e insumos químicos. A indústria petroleira adaptou o uso de GC para a análise de composição e avanços excepcionais para o desenvolvimento e aplicações foram alcançados pelos principais pesquisadores das companhias.
Em uma análise de cromatografia gasosa convencional, algumas amostras apresentam significativa quantidade de compostos que não são separados facilmente, as quais contribuem para a sobreposição de picos. Apesar da utilização de diferentes parâmetros de separação e de programação das condições instrumentais, há possibilidade de separações com baixa eficiência. Um exemplo disso é a dificuldade de identificar e de quantificar os compostos presentes em amostras de biodiesel/diesel, ainda que a análise seja realizada por meio do monitoramento seletivo de íons em cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas. Além do controle das condições instrumentais e dos parâmetros de separação em cromatográfica gasosa, normalmente, é utilizado técnicas de preparo de amostra, que têm como objetivo transformar a substância de interesse em um derivado com as características adequadas para ser analisada. No entanto, a etapa de preparo de amostra, tanto a extração em fase líquida quanto a sólida, pode ocasionar perdas relevantes de compostos e assim comprometer a análise. Outros aspectos a serem considerados são i) o consumo de maior parte do tempo da análise; ii) a fonte de erros, principalmente, na análise de traços; e iii) a produção de resíduos.
A modulação é uma das etapas fundamentais do sistema GCxGC pois é responsável pela coleta ou amostragem contínua de frações pequenas do eluato provenientes da coluna da primeira dimensão ou primária (1D), reconcentração ou focalização dessas frações em bandas estreitas e sua subsequente reinjeção na coluna da segunda dimensão ou secundária (2D). Assim, o modulador é um sistema de transferência de massa localizados entre as colunas em um sistema de GCxGC. Os diferentes tipos de moduladores possuem vantagens e desvantagens distintas, mas possuem uma função em comum que é isolar e transferir o eluente da coluna 1D para a coluna 2D o mais rápido e eficiente possível. O desempenho dos moduladores pode ser avaliado por quatro parâmetros: período de modulação, taxa de transferência, largura do pulso de injeção e a capacidade de pico resultante proveniente da separação da coluna 2D. O período de modulação (PM) definido como o tempo em que o modulador amostra o eluato da 1D e o conduz para a 2D, isto é, o tempo de execução da separação na coluna 2D, é de extrema importância por influenciar na qualidade do cromatograma. Outro ponto importante do PM é que a sequência de amostragem e reinjeção deve ser definida e repetida de forma precisa ao decorrer de toda a análise cromatográfica e, para minimizar a ocorrência de picos fora do ciclo é necessário que a separação na 2D tenha ocorrido antes da injeção da fração cromatográfica da coluna ¹D subsequente. Os PM típicos compreendem uma faixa de 1 – 10 s e esse período deve ser selecionado para complementar a largura de base (Wb) dos picos da coluna 1D.
Moduladores criogênicos
Dentre os diversos tipos de moduladores existentes, os criogênicos se destacam como uma alternativa simples e robusta. O princípio de funcionamento de tais dispositivos se baseia na criação de armadilhas criogênicas de resfriamento que viabilizam a coleta e reconcentração de frações do analito da 1D. Um dos moduladores criogênicos mais antigos é o sistema criogênico longitudinalmente modulado (LMCS, do inglês Longitudinally Modulating Cryogenic System), que opera através de resfriamento indireto. No entanto, moduladores baseados em jatos frios têm sido cada vez mais difundidos. Diferentemente da geração anterior de moduladores que utilizam de camisa de refrigeração, os de jato frio operam baseados no jateamento de gases comprimidos (dióxido de carbono ou nitrogênio).
Moduladores térmicos sem criogenia
O uso de moduladores na cromatografia gasosa caracteriza a técnica de Cromatografia Multidimensional abrangente a qual é conhecida desde 1991 quando Liu e Phillips utilizaram um modulador de dessorção térmica (DT) de estágio duplo para a entrada de amostra, diferenciando-se da cromatografia gasosa convencional. Nos dispositivos de estágio duplo, dois eventos em série ocorrem em duas zonas diferentes do modulador. Umas dessas zonas pode usar o método de criogenia (uso de gases em estado líquido para acelerar o resfriamento) ou não. Embora a modulação criogênica seja eficaz, é uma técnica relativamente dispendiosa. Consequentemente, o conceito e o desenvolvimento de uma modulação livre de criogenia e de baixo custo é de grande interesse. Como exemplos de moduladores térmicos que não utilizam o método de criogenia para resfriamento temos:
Modulador de estado sólido
O modulador de estado sólido faz parte do grupo de moduladores térmicos que não utilizam a criogenia para o resfriamento. Neste caso, é utilizado o resfriamento termoelétrico para a redução da temperatura, o tornando uma alternativa com menor custo operacional. Guan & Qiang descreveram na patente U.S. 8277544, Inc., 2010 o modulador térmico independente (TiM, Thermal independent Modulator), que foi desenhado para a utilização fora do forno do cromatógrafo, o que proporcionava uma grande economia energética, uma vez que os moduladores presentes dentro do forno do cromatógrafo precisavam gastar muito mais energia com o resfriamento devido ao calor do forno. Além disto, este dispositivo contava também com o resfriamento termoelétrico (TEC, Thermoeletric Cooling) de 3 estágios, com o aquecimento das extremidades do modulador e com a utilização de uma coluna capilar.
Moduladores de fluxo
Os moduladores de fluxo (FM) são moduladores que utilizam de um fluxo de gás para controlar e isolar porções do eluato da coluna 1D e reinjetá-las na coluna 2D para separação. O desenvolvimento dos moduladores de fluxo iniciou-se a com base nos moduladores de válvula. Apesar de serem semelhantes aos moduladores de válvula, os moduladores de fluxo possuem duas colunas de fluxo acopladas. O modulador fluídico ou de fluxo diferencial foi o design de modulador de fluxo pioneiro e subsequentes moduladores fluídicos foram baseados no modelo original desenvolvido entre os anos 2000 - 2006. O princípio operacional desses moduladores consiste na alternância entre os ciclos de acumulação (fill) e injeção (flush) do canal de coleta controlado por uma válvula solenóide de três vias de ação rápida alocada fora do forno do cromatógrafo. A adesão dos moduladores de fluxo diferencial em um sistema GCxGC ocorreu a partir da comercialização da Tecnologia de Fluxo Capilar (CFT) (em inglês, Capillary Flow Technology) em placas microfluídicas com dinâmica de injeção “forward fill/flush” (FFF).
SSL
Na cromatografia a Gás existem diversos injetores que podem ser utilizados, dentre eles, o Injetor Split Splitless (SSL) que apresenta um papel de destaque, visto seu alto grau de eficiência na injeção de amostras por vaporização em colunas capilares. Em Química Analítica é importantíssimo que as análises sejam otimizadas para que os erros analíticos sejam diminuídos a fim de obter resultados mais precisos, e, o SSL possui um mecanismo de funcionamento favorável para eliminar erros, além de outras vantagens quantitativas e qualitativas. O nome atribuído ao injetor provém dos modos em que ele pode ser usado, Split e Splitless. Por dentro do equipamento, ocorrem múltiplas ações simultâneas e precisas no momento da injeção. As técnicas são direcionadas pelo operador de acordo com a atribuição analítica, logo, é o operador quem define o modo em que o injetor funcionará. Em vias gerais há poucas disparidades entre o uso nos dois modos, porém cada uma possui características que se adequam melhor para um tipo de análise específica.
PTV
Quando o equipamento realiza a transferência da amostra para a coluna cromatográfica há o desafio de conseguir manter a integridade química da mesma, essa é uma etapa crucial, pois está relacionada com a exatidão e precisão dos resultados. Pode-se acrescentar o fato de que existem amostras de matrizes complexas com inúmeras substâncias químicas diferentes que em um injetor convencional não seria possível a separação correta e precisa. O injetor vaporizador de temperatura programável (do inglês Programmed Temperature Vaporizing - PTV) foi projetado com a capacidade de evitar a segregação de componentes pesados, diminuir a perda de compostos de baixo peso molecular, minimizar a decomposição de compostos termicamente instáveis, por conta das diferentes taxas de vaporização, além de injetar grandes volumes (100 µl) quando os pontos de ebulição dos componentes da amostra e do solvente diferirem em mais de 100°C e melhorar o foco na entrada da coluna.
SPME
Nos métodos cromatográficos podemos nos deparar com amostras não compatíveis com o sistema cromatográfico onde a separação ou detecção só é possível se houver um preparo de amostra preliminar. A etapa do preparo de amostra é muito importante para que sejam alcançados resultados confiáveis e reprodutíveis. O conceito básico desta etapa é converter uma matriz real em uma amostra adequada para a análise. Para que esta etapa seja bem sucedida é necessário entender todo o processo de análise de um componente específico de uma amostra, incluindo suas propriedades físico químicas, condições ambientais e os componentes da matriz da amostra. As técnicas empregadas para o preparo de amostra segundo modelos de transferência de massa podem ser divididas em: extração em equilíbrio e pré-equilíbrio em sistemas de fluxo, extração em pré-equilíbrio em batelada e extração exaustiva e não exaustiva em estado estacionário. Dentre todas as técnicas de extração, sendo ela exaustiva ou não exaustiva, há um princípio termodinâmico fundamental em comum envolvendo o equilíbrio do analito na fase extratora e na amostra. Este equilíbrio, baseado na afinidade do analito com a fase extratora, é representado pela constante de distribuição, Kes, calculado pela razão da atividade do analito na fase extratora e na matriz, ae e as respectivamente, podendo ser substituído por suas devidas concentrações, Ce e Cs.
Em relação aos arranjos de colunas mais utilizados são:
Arranjo inverso
No contexto da cromatografia gasosa existem mais de uma técnica para garantia da seletividade da coluna cromatográfica, sendo uma delas a coluna de arranjo normal, arranjo inverso ou fase reversa como também é comumente denominado e colunas quirais. Antes de entrarmos propriamente na explicação do arranjo inverso, aplicada a cromatografia gasosa bidimensional abrangente, é interessante o entendimento deste termo para a cromatografia convencional. Para cromatografia convencional (GC) em fase reversa, a fase estacionária apresenta polaridade mais intensa ao comparado com a fase móvel, em vista disso as fases móveis em fase estacionária reversa apresentam maior concentração de solvente apolar. Outra característica a ser citada é quanto ao fator de retenção da amostra (K), o mesmo aumenta para compostos mais hidrofílicos. Portanto, nesse tipo de coluna as moléculas hidrofílicas eluem primeiro enquanto que as moléculas hidrofóbicas eluem por último. Embora a cromatografia de fase reversa seja proposta como um método que pode ser aderido, o mesmo é menos utilizado devido a incompatibilidade de variedades de solventes com as fases de cromatografia gasosa.
Arranjo com colunas quirais
O uso de cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC×GC) aprimora a seletividade e sensibilidade do sistema cromatográfico adotado para a separação de isômeros. Isso deve-se ao fato de que é possível definir arranjos de colunas com seletividades diferenciadas como a escolha de fases estacionárias comuns em uma dimensão e fases próprias para isômeros em outra dimensão. Esta combinação de mecanismos de separação permite maximizar a separação de analitos em matrizes complexas. Além disso, é importante entender quais tipos de isomeria existem entre os componentes para a escolha do melhor arranjo de colunas nas diferentes dimensões. A isomeria pode ser definida como moléculas de composição atômica idênticas, porém com diferentes arranjos de ligações dos átomos ou orientação dos átomos no espaço. Assim, substâncias de mesma formula molecular são chamadas de isômeros. Existem três tipos de isomeria: constitucional, configuracional e conformacional. Os isômeros constitucionais possuem a mesma composição atômica, porém arranjo de ligações diferentes, por exemplo, as moléculas catecol, resorcinol e hidroquinona, apesar de possuírem a mesma formula molecular, possuem posicionamentos distintos das hidroxilas ligadas ao anel aromático promovendo diferenças nas propriedades físico-químicas dos compostos. A isomeria conformacional está relacionada com a posição espacial de cada átomo na molécula, como as diferentes conformações que o ciclohexano pode assumir, cadeira ou barco. Por fim, a isomeria configuracional refere-se às relações geométricas entre átomos da molécula. Os diferentes exemplos deste grupo incluem as isomerias geométricas cis e trans em moléculas que apresentam insaturações, por exemplo cis- e trans-2-buteno ou diastereoisômeros, e a isomeria enantiomérica ou óptica, cujo par de moléculas possui um ou mais centros quirais. Assim, dois isômeros enantioméricos são estruturas espelhadas uma da outra, ou seja não são sobreponíveis. Entre os diferentes exemplos de compostos que apresentam quiralidade, uma estrutura comumente estudada é o 2-butanol, que apresenta dois isômeros (+)-2-butanol e o (-)-2-butanol.
A resposta produzida pelo detector é relativa aos compostos separados pela coluna cromatográfica, na forma gasosa. Após a separação dos compostos, fluxos limitados são direcionados ao detector, permanecendo por um tempo muito curto (alguns segundos), sendo assim, o detector deve ser eficiente para transformar a resposta obtida em sinal elétrico durante esse tempo. O detector pode ser usado para quantificar espécies definidas em uma amostra ou para fornecer informações estruturais sobre compostos específicos. Para isso, é necessário conhecer o funcionamento do detector o qual pretende-se usar, sabendo que o sinal é gerado em função de alguma propriedade física ou química dos compostos a serem analisados. Para obter os melhores resultados é interessante conhecer os parâmetros operacionais e os mecanismos de detecção de cada detector para obter as melhores respostas. Um dos requisitos para o detector GCxGC, é a rapidez na aquisição das respostas. Devido a separação abrangente, as larguras das bases dos picos são na faixa de 50 a 200 ms, sendo necessário taxas de aquisição mínimas de 100 Hz. Em muitas aplicações, os detectores de GC são bem aplicáveis a GCxGC.Devido à pequena largura de pico na segunda dimensão são necessários detectores adequados. Por exemplo: detector por ionização em chama (FID), detector termoiônico (TID) e espectrométrico de massas com analisadores quadrupolares rápidos (Q) ou por tempo de voo (TOF).
FID
Dentre os detectores mais comuns, considerado universal, o detector com ionização por chama (do inglês, flame ionization detector - FID) possui taxa de aquisição com até 300 Hz de frequência e eficiência tanto para quantificar como para a identificar os picos nos gráficos 2D, pela relação entre a estrutura (já que o FID informa o número de carbonos efetivos do composto) e a retenção. O detector FID, consiste em uma pequena chama de difusão de hidrogênio-ar a qual está posicionada no final da coluna cromatográfica. Após a separação, o gás transportador da coluna é direcionado para o interior da chama e os compostos orgânicos são queimados, gerando espécies carregadas. A mais de 300 V acima da chama é posicionado um eletrodo coletor, o qual atrai os íons gerados produzindo um aumento na corrente do eletrodo, referente aos compostos queimados na chama. A geração de íons na chama se dá em diferentes regiões. A mistura de gases (gás carreador, gás de makeup e hidrogênio) passa na ponta do jato em um determinado fluxo, gerando energia térmica. Ao se expandir, entra em contato com o ar que é injetado pela parte externa do jato, e devido a energia térmica produzida, a mistura de gases é pré-aquecida por retrodifusão.
ECD
O detector por captura de elétrons (do inglês, Electron Capture Detector – ECD) está entre os mais comuns, é seletivo e altamente sensível e robusto para compostos eletrofílicos, ou seja, que “capturam elétrons”. Dentre esses compostos, os halogenados, como por exemplo os pesticidas, destacam-se no escopo das principais análises utilizando esse detector,,. Além disso, o ECD é um detector de ionização, porém, ao contrário do FID, é um detector do tipo de concentração e de propriedade em massa, que nesse caso é uma exceção, uma vez que no geral os detectores de propriedade em massa não são muito sensíveis. Dentre os detectores de ionização, o ECD é o segundo mais utilizado em cromatografia gasosa e deve sua popularidade à sua sensibilidade. Além disso, têm sido amplamente utilizado em cromatografia bidimensional abrangente por oferecer alta taxa de aquisição e a capacidade de caracterizar com precisão os picos estreitos produzidos por um sistema GC×GC.
NPD
O detector nitrogênio-fósforo (do inglês, Nitrogen-Phosphorus Detection - NPD) é classificado como um detector de ionização termiônica (do inglês, Thermionic Ionization Detector - TID). Diferentemente do FID, detectores termoiônicos não são aquecidos diretamente, isto é, não apresentam chama, e a característica principal se torna a presença de uma cerâmica aquecida por corrente elétrica. Com a cerâmica em alta temperatura, forma-se um plasma localizado em sua superfície, o que favorece as reações de decomposição e de ionização. Por não apresentar chama, o NPD possui maior eficiência de ionização e maior sensibilidade para compostos com nitrogênio e fósforo quando comparados com o FID. Para os dois parâmetros, o NPD pode ser até 10000 vezes melhor do que o FID.
PolyArc
O sistema PolyArc é um microrreator que foi integrado na cromatografia gasosa para aumentar a resposta do FID. Esse conceito foi inserido por Porter & Volman, melhorado por Johns & Thompson e hoje é comum nos laboratórios, sendo conhecido como um metanizador aperfeiçoado. Em primeira análise, compostos como monóxido de carbono (CO), dióxido de carbono (CO2), dissulfeto de carbono (CS2), ácido fórmico (CH2O2) e formaldeído (CH2O) estão fora do escopo de detecção do FID. Ademais, a necessidade do uso de um padrão de referência para uma análise quantitativa precisa são algumas das limitações presentes. Diante disso, o uso do reator se mostra eficiente ao detectar esses componentes, além do fato de quantificar compostos com precisão sem utilizar material de referência. Nesse caso é necessário calibrar apenas o tempo de retenção.
VUV
O detector ultravioleta no vácuo (VUV - vacuum ultraviolet detector) foi desenvolvido recentemente como uma opção aos detectores de cromatografia de gás comuns. Historicamente, a análise no VUV foi mantida em instalações sincrotron com células de fluxo que estão sob vácuo, daí o nome. O vácuo pode ter sido usado para reduzir a absorção de fundo, como o ar e umidade, no entanto para medidas nesta faixa de comprimento de onda pode-se reduzir essa absorção de fundo usando gases como hélio, nitrogênio, argônio e hidrogênio. Este detector mede a absorção de espécies químicas da fase gasosa na faixa de 120–240 nm, onde todos os compostos químicos apresentam espectros de absorção únicos. Nesta faixa de comprimento de onda, as transições eletrônicas de alta energia que podem ser excitadas e sondadas são :
Antes de discutir o acoplamento da cromatografia a gás bidimensional abrangente (GC×GC) com espectrômetros de massas de alta resolução da “geração Orbitrap”, é importante entender como essa nova família de espectrômetros surgiu e se desenvolveu. Tudo começou em 1923 com um trabalho teórico de K.H. Kingdon, que descrevia uma armadilha orbital de íons composta por uma casca cilíndrica com um fio coaxial central, fechada nos polos por flanges. Com a aplicação de uma diferença de potencial entre a casca e o eletrodo central, os íons no interior eram atraídos pelo fio, e somente aqueles que possuíam uma velocidade tangencial adequada “orbitavam” o eletrodo central. Os íons oscilavam de polo a polo da armadilha por conta da curvatura do campo eletromagnético provocada pelas flanges. Ao longo das décadas seguintes a instrumentação para controle dos íons foi se desenvolvendo a medida que outros analisadores de massas surgiram, como o Analisador por Setor Magnético, Quadrupolo, Ion Trap, e o analisador por Tempo de Voo. Em 1981, R.D. Knight conseguiu utilizar uma armadilha orbital para a determinação da massa de íons gerados por laser in situ. O aparelho era construído com duas cascas cônicas isoladas entre si, que envolviam um eletrodo central em formato de fio. Todo o sistema era mantido evacuado (1,3.10-10 atm ou 10-8 torr). Nas cascas aplicava-se uma tensão variável com frequência compatível com os íons gerados (tensão RF), que orbitavam o eletrodo central em um movimento de espiral, que oscilava de uma casca a outra. A frequência de oscilação era proporcional a razão da massa pela carga dos íons (m/z). A detecção ocorria pela variação da frequência RF entre as cascas de forma a produzir ressonância entre o campo elétrico variável e o movimento oscilatório dos íons. A taxa de perda de íons era monitorada por uma fotomultiplicadora colinear ao eixo do eletrodo central, ou por uma placa coletora externa. O instrumento não permitia a detecção simultânea de várias espécies de íons, nem mesmo de misturas simples, mas já demonstrava o potencial da técnica para a espectrometria de massas.
LC
A análise multidimensional é considerada uma técnica de combinação entre duas ou mais etapas analíticas. Portanto, a separação cromatográfica realizada por meio de LC-GC, GC-GC e GC/MS utilizam métodos tipicamente multidimensionais. A hifenação corresponde ao acoplamento de tipos específicos de técnicas de detecção, ou a utilização de diferentes abordagens de análise em dimensões não relacionadas, ou seja, que geram informações diferentes (ortogonais) de uma análise para melhorar o desempenho de separação, a qualidade dos dados de uma análise, com objetivo de conquistar uma ferramenta analítica mais rápida e eficiente em comparação com as técnicas convencionais. Eles podem ser chamados coletivamente de métodos multidimensionais.
QMS
Desde o surgimento da técnica de GCxGC, ela foi associada aos detectores por ionização em chama (FID), pois possuem alta taxa de aquisição (até 200Hz) e boa resposta a quase todos os compostos orgânicos, com boa performance em análises quantitativas. Porém, os detectores FID não fornecem informações estruturais, o que tornou a utilização de acoplamentos com analisadores de massa comum em análises de identificação e/ou confirmação de compostos. Os princípios fundamentais da técnica de espectrometria de massas datam dos anos 1980, quando J. J. Thomson determinou a razão massa/carga do elétron e do estudo de Wien sobre a deflexão magnética de raios anódicos, determinando que os raios eram carregados positivamente. Entre os anos de 1912 e 1913, Thomson estudou o espectro de massas de gases atmosféricos, demonstrando assim a existência de isótopos.
QqQMS
Cromatografia a gás bidimensional abrangente (2D – GC) foi relatada pela primeira vez em 1991. A técnica se baseava no uso de duas colunas capilares (com composições de fase estacionária diferente) dentro de um mesmo forno ou em fornos diferentes. Um dispositivo de transferência, conhecido como modulador, era posto entre as duas colunas, o qual transferia sequencialmente as partes da primeira dimensão (1ª coluna) para a segunda (2ª coluna). A primeira coluna (¹D) geralmente apresentava uma baixa polaridade e conseguia separar compostos de acordo com suas pressões de vapores, já a segunda coluna (²D) possuía uma polaridade mais significativa, que poderia realizar interações como ligações de hidrogênio, dipolo – dipolo, entre outras. Dessa forma, ela conseguiria separar uma classe de compostos diferentes da primeira.
QqTOF (Alta Resolução)
Ao acoplar um espectrômetro de massas do tipo QTOF no cromatógrafo é possível ter seletividade maior como também reduzir as chances de se obter resultados falso positivos nas análises. O analisador de massas consegue medir a razão massa-carga dos íons (m/z) e através dessa informação é possível fazer a separação desses íons. Os valores de m/z no caso de íons multiplamente carregados são representados por frações das massas reais desses íons. Para que isso se torne possível a medir m/z é preciso primeiramente ionizar a molécula em análise para que ela possa ser repelida ou atraída através dos campos magnéticos. A técnica mais conhecida é a ionização de elétrons (EI), onde amostra passa através de uma fonte de ionização no equipamento, que é aquecida e está sob vácuo, fazendo com que as moléculas sejam ionizadas ou vaporizadas. A ionização é realizada através de um feixe de elétrons que passa pela molécula e por ter um alto grau energético (70 eV) esses elétrons conseguem causar uma excitação nas moléculas neutras e o resultado normalmente é a perda de um elétron (ionização).
TOF (baixa resolução)
A cromatografia gasosa bidimensional (GCxGC) foi desenvolvida para atender à uma crescente demanda por análises de amostras complexas e para lidar com limitações, como capacidade de pico, faixa dinâmica e especificidade restrita de sistemas GC unidimensionais (1D-GC). Na verdade, a adição de uma segunda dimensão cromatográfica com uma fase estacionária complementar pode aumentar a separação e o poder de resolução de GCxGC sobre 1D-GC em, aproximadamente, 10 vezes. A GCxGC-TOFMS possui recursos de separação superiores realizados em duas fases estacionárias diferentes, alta seletividade e resolução aprimorada o que facilita a identificação e quantificação aprimoradas de analitos em nível de traço, sendo assim uma alternativa para análise de matrizes complexas, como voláteis de alimentos e bebidas.
TOF (alta resolução)
Como já abordado nas demais seções, a cromatografia gasosa bidimensional (GCxGC) é uma técnica analítica empregada na separação de substâncias químicas em matrizes complexas. Nesta técnica são conectadas em série duas colunas capilares de seletividade distintas, sendo uma de caráter químico hidrofílica, e a outra hidrofóbica. De modo geral, o efluente da primeira coluna é desviado de modo contínuo para uma segunda coluna curta. Com o poder de resolução da segunda coluna é limitado, uma coluna antecedente tem como objetivo uma melhor separação de picos Alguns utilizam como argumento a complexidade da técnica em si para não aplicá-la em laboratórios analíticos de rotina. Porém, vários métodos validados utilizando esta técnica demonstram que a mesma se apresenta extremamente precisa e robusta, possuindo aplicações em diversas áreas da química como meio ambiente, indústrias petroquímica, metabolômica, alimentos e também fragrâncias. As principais vantagens da aplicação incluem a maior resolução de picos, a estrutura bidimensional dos cromatogramas e também confere uma maior sensibilidade à técnica, tem sido empregada com a espectrometria de massas, e além de análises com separações de alta resolução, é possível através dessa combinação identificar componentes minoritários, distinguir compostos similares, e também de “desembaraçar” espécies que são eluídos juntos.
Atualmente três grandes empresas vêm competindo pelo mercado GC×GC: Zoex, LECO e Shimadzu. A Zoex e LECO são as principais fornecedoras para os equipamentos GC×GC-TOFMS, fornecendo também software para a leitura e interpretação de dados. Porém o software da LECO, ChromaTOF, tem seu uso restrito aos equipamentos da própria empresa, modelos Pegasus 4D. Já o software da Zoex, GCImage, é compatível com todas plataformas de dados abrangendo de GC×GC-FID até GC×GC-MS (tanto analisadores quadrupolares e por tempo de voo) das mais diversas fabricantes. E mais recentemente a Shidmazu lançou seus equipamentos GC×GC-qMS, devido a maior velocidade de varredura de seus novos analisadores quadrupolares (até 20.000 Th por segundo).
A análise de alimentos é crucial para o controle de qualidade e segurança alimentar desde seu valor nutricional até seu armazenamento para que evite contaminações (Kudlejova, L., Risticevic, S.). A técnica por GCxGC tem grande vantagem frente às outras, devido ao número máximo de compostos que podem ser separados em uma mesma análise (PEDROSO,2009). Esse método de análise nos permite determinar o sabor de uma alimento por exemplo, como fez Mohamed Adahchour; Jaap Wiewel; Ramon Verdel; René J.J.Vreuls e Udo A.Th.Brinkman com a Manteiga. O teste foi realizado por meio de microextração de fase sólida em dois tipos de manteiga fresca, onde houve o preparo da amostra, o que é necessário em vários tipos de análise para métodos GCxGC, colocando-as em condições adequadas. Na coluna de primeira dimensão usou-se 30m x 0,25 mm ID, 0,25 μm BP21 (polietilenoglicol, tratado com TPA) (SGE Europa) e na de segunda dimensão usou-se BPX-35 de 1 m × 0,1 mm, 0,1 μm (SGE Europa) e ambas foram conectadas. houve análise de compostos polares através de fase aquosas da amostra que quando submetidos a dois níveis de temperatura (40° e 170° C) ficou nítida a diferença dos compostos nos cromatogramas quando a temperatura era elevada, sendo analitos polares e compostos polares evidentes com maior intensidade. Várias classes de compostos desconhecidos foram detectados. Separação aprimorada, fornecimento de informações, problema de resolução, limites de detecção, tempo de retenção (primeira e segunda), logo todos esses aspectos e alguns outros específicos da amostra e da análise mostraram-se eficientes e melhores identificados pela técnica GCxGC.
Metabolômica
A metabolômica é o estudo que visa identificar, caracterizar e quantificar o conjunto de todos os metabólitos – o metaboloma – produzidos e/ou modificados por um organismo. Devido à excelente capacidade de separação para misturas complexas de produtos químicas, a cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GCxGC) está sendo utilizada com crescente frequência para análises metabolômicas. A seguir, algumas aplicações recentes foram selecionadas para demonstrar como os estudos de metabolômica com GCxGC podem facilitar descobertas e impulsionar a ciência em diversas frentes. As bactérias produzem metabólitos voláteis característicos e isso pode ser utilizado para uma gama de aplicações na medicina, ciência e indústria. Uma possível aplicação é para diagnosticar infecções de bactérias patogênicas in situ, ou seja, direto de uma ferida, de uma amostra de urina ou da respiração, sem ser necessário recuperar os micróbios ou seu material genético – isso reduziria as chances de um falso-negativo, além de proporcionar um diagnóstico mais rápido. O método de cromatografia gasosa–espectrometria de massa (GC-MS) foi utilizado por décadas para a identificação não-direcionada de metabólitos voláteis de culturas bacterianas. O trabalho pioneiro na aplicação do método de GCxGC para este propósito analisou os metabólitos voláteis da bactéria Pseudomonas aeruginosastrain PA14, uma bactéria já muito bem estudada pelo método anteriormente utilizado (GC-MS) e demonstrou o ganho de informações quando utilizado do GCxGC (no trabalho, utilizaram GCxGC-TOFMS), que, com o novo método, praticamente dobrou os metabólitos voláteis identificados.
Lipidômica
O termo lipidômica se refere ao estudo dos lipídios celulares - o lipidoma. Nesse contexto, a lipidômica se concentra na investigação das estruturas, funções, interações e dinâmica dos lipídios celulares, na sua localização e dinâmica dentro dos compartimentos celulares, e nas suas mudanças diante de alterações na célula, além de ser o estudo das interações lipídios-lipídios e lipídios-proteínas que participam dos processos fisiológicos e fisiopatológicos. Portanto, essas análises contribuem para o avanço da nutrigenômica e para o surgimento de novos biomarcadores de diversas doenças, bem como a compreensão dos mecanismos moleculares. Na última década estão cada vez mais populares as corridas de resistência (> 5 km). A participação nesses eventos requer uma preparação extensiva, incluindo condicionamento físico e mental, além de recuperação eficiente do sistema após a atividade. Estudos mostram que em atletas de resistência após as atividades tem seu metabolismo perturbado, principalmente em concentrações elevadas de carboidratos, ácidos graxos e cetonas, acompanhadas por reduções nas concentrações de aminoácidos5. Foi sugerido que essas alterações resultem da dramática mudança metabólica em várias vias de catabolismo de substrato de combustível, bem como mecanismos alternativos de produção de energia (α-oxidação e autofagia). Stander, et al. (2020) utilizaram uma abordagem não direcionada de (GCxGC-TOFMS) para investigar a recuperação metabólica sem intervenção de 16 atletas de maratona dentro de 48 horas pós-maratona. As amostras de sangue (n = 64 amostras) foram coletadas 24 horas pré-maratona, 30 minutos pós-maratona, 24 horas pós-maratona e 48 h pós-maratona. Todas as amostras foram submetidas a uma extração de metaboloma total. Foi realizada a derivação/sililação utilizando 40 μL de BSTFA enriquecido com TCMS a 1% a 60 ° C por 60 min. As análises foram realizadas utilizando GCxGC-TOF/MS com os seguintes parâmetros operacionais. O volume de amostra injetado foi de 1 μL com proporção de divisão de 1:3 utilizando Hélio como gás de arraste com vazão de 1 mL/min. A temperatura do injetor foi mantida constante a 270 °C. A coluna 1D foi do tipo capilar Restek Rxi-5MS (30 m; 0,25 μm de diâmetro e 0,25 μm de espessura de filme) operando sob a programação de temperatura inicial de 70 °C com taxa de aquecimento de 4 °C/min até a temperatura final de 300 °C (mantido por 2 min). A coluna 2D do tipo capilar Restek Rxi-17 (1 m; 0,25 μm de diâmetro e 0,25 μm de espessura de filme), operou com temperatura inicial de 85 °C, a uma taxa de 4,5 °C / min até a temperatura final de 300 °C. O modulador térmico, entre as duas colunas, foi configurado para pulsar intermitentemente fluxos de gás nitrogênio quente e frio por aproximadamente 0,5 s a cada 3 s.
Petroleômica
Petroleômica é o estudo da caracterização do petróleo a nível molecular, que identifica diversos compostos de hidrocarbonetos e polares. Usada nos estudos desde a formação do óleo até o seu refino. Por serem amostras de grande complexidade química é necessário o uso de técnicas analíticas modernas como a cromatografia gasosa bidimensional abrangente (GC x GC) para que seja feito a análise. A técnica de GC x GC é utilizada em diversas áreas, mostrando seu poder de separação, mas seu uso e grande potencial de separação ganham destaque com as amostras petroquímicas, em razão da complexidade delas. A gasolina, o óleo cru, o querosene, o combustível diesel, o gasóleo leve, os solventes não aromáticos, os biomarcadores, os poluentes ambientais no solo e sedimentos, os poluentes ambientais na água, e os poluentes ambientais no ar, são exemplos de amostras petroquímicas em que a técnica GC x GC é aplicada. Dentre os compostos petroquímicos comumente identificados estão: n-alcanos ou parafinas, alcenos ou olefinas, alcanos cíclicos ou naftenos, alcenos cíclicos, aromáticos, heterocompostos, entre outros. Na sequência serão apresentadas algumas situações em que a técnica em questão foi utilizada na área petroleômica.
Análise de combustíveis
As fontes de energia podem ser de origem fóssil, como o carvão, o petróleo e o gás natural, de fontes renováveis (a partir de diferentes biomassas), ou nuclear. O processo de refino do petróleo dá origem a diferentes tipos de combustíveis e outros produtos, como resumido na tabela abaixo: Alguns exemplos de biocombustíveis, produzidos a partir de fontes renováveis, também serão apresentados a seguir. A utilização da técnica de GC x GC na análise de combustíveis pode trazer diversas informações sobre suas composições, presença de grupos específicos (por exemplo, grupos aromáticos e oxigenados), relações entre a composição e as propriedades físicas, informações sobre a origem de alguns biocombustíveis e adulterações, tanto em relação aos excessos nas quantidades já permitidas pelas agências reguladoras, como na adição de componentes estranhos à composição convencional.
Análise de óleos essenciais
Os óleos essenciais (OE) são elementos voláteis resultantes do metabolismo secundário das plantas, normalmente encontrados nos caules e folhas. Os EOs constituem misturas complexas de compostos voláteis a semivoláteis com diversas estruturas químicas e isoméricas, incluindo várias classes de compostos de grande interesse industrial. Como resultado, a identificação precisa desses voláteis em matrizes biológicas, especialmente quando em misturas, continua sendo um desafio que garante o desenvolvimento contínuo de métodos de detecção e separação abrangentes rápidos e eficientes. Dentre as técnicas analíticas utilizadas para análise da matriz complexa de óleos essenciais, a cromatografia gasosa bidimensional abrangente vem ganhando cada vez mais destaque, principalmente no que diz respeito ao controle de qualidade e autenticação de EOs. Um exemplo disso é o trabalho realizado por Fillipi, em que a cromatografia bidimensional (CG x CG-FID/ MS) ) possibilitou a separação eficiente de 135 componentes do óleo de vetiver pela primeira vez.
Análises forenses
O uso da técnica de GCxGC em investigações forenses tem se desenvolvido nos últimos anos, tornando-se uma ferramenta muito popular em laboratório analíticos, onde químicos lidam diariamente com amostras complexas. Com o aumento da razão sinal ruído e capacidade de geração de picos com mais detalhes direciona a uma tendência de uso ao invés da tradicional técnica de GC em uma dimensão. Em ciências forenses podem ser encontradas em trabalhos como análise de drogas de abuso ou ilícitas, toxicologia forense, análise de resíduos de incêndio, como investigação ARSON análise de fósseis, análise ambiental e forense química, biológica, radioativa e nuclear (do inglês CBRN – Chemical, Biological, Radiocative, Nuclear), cheiro humano, além de outras.
